Протеомный анализ в офтальмологической практике и его перспективы

Проведение протеомного анализа слезы при дифференциальном исследовании  патологий в офтальмологии и его возможности

Внимательное глубокое исследование состава белков слезной жидкости у людей, не имеющих патологий, вызвавшихся на добровольной основе участвовать в исследовании, позволило создать международные базы данных с систематизацией всей имеющейся информации. Благодаря этому, офтальмологи получили возможность идентифицировать белки, так называемые «маркеры» разных болезней глаз во время различительного обследования патологичных процессов глаз. На данном этапе в процессе изучения больше всего рассмотрены нарушения протеома слезы при диагнозе «синдром сухого глаза» (ССГ). Кроме того, изучены происходящие процессы и при других заболеваниях задней области глаз: глаукоме, кератоконусе, катаракте, а также при диабетической ретинопатии и ВМД (возрастная макулодистрофия).

Протеомное картирование образцов слезы при ССГ

Протеомика слезы у людей, жалующихся на неудобства, сухость и ощущение, что в глазу соринка, позволит получить информацию для дифференциального диагностирования патологии глазной поверхности. К примеру, диагноз ССГ при ДМЖ (дисфункция мейбомиевых желез), либо с дополнительным офтальмологическим эндокринным патологическим процессом, в том числе и болезнь Шегрена.

Сравнение образцов слезной жидкости у больных с диагнозом ССГ в связи со снижением слезной жидкости и нарушением работы мейбомиевых желез показало существенное снижение экспрессии 26 белков и увеличение степени сывороточного альбумина при уменьшении секреции слезы у исследуемых . Стоит отметить, что патологические процессы глазной поверхности ввиду снижения продукции слезной жидкости коррелируют с белковой утратой. В задачи этих белков входит защита от возникновения воспаления. Они также отвечают за получение Т-клеточного иммунного ответа: лактоферрин, липокалин 1, пролин, в составе которого высокий уровень белка 4, липофилин А и липофилин С.

Такие патологические процессы протеома слезы обнаружены у людей с синдромом СГ и нарушением функции мейбомиевых желез с синдромом Шегрена. Стоит заметить, что повышенный воспалительный процесс белков – трансферрин с С-реактивным белком и существенное уменьшение лизоцима, лактоферрина и эпидермального фактора роста обнаружены и при аутоиммунной системной патологии соединительной ткани. Это говорит о том, что присутствует хронический вяло протекающий воспалительный процесс при болезни Шегрена.

Проведенное клиническое изучение протеома слезной жидкости у испытуемых с ССГ и эндокринной офтальмопатией показало, что прогрессирующее развитие этого воспалительного заболевания связано с тем, что активируются  воспалительные белки, а выработка протеинов, которые являются защитными, подавляется. Выделение определенных соединений молекул и панелей белков в образцах дает возможность отделить эндокринные патологические заболевания и ССГ. Стоит также отметить, что было найдено существенное нарушение экспрессии 83 белков в образцах, взятых у больных, форма эндокринной офтальмологической патологии которых была неактивна после проведения декомпрессионной орбитотомии. На основе проведенного анализа можно заключить, что такие исследования дают возможность определить точнее обособленные частицы патогенного процесса эндокринной офтальмологической патологии, основой которых является пучеглазие, возникшее у людей с заболеванием, форма которого неактивна.

Протеомный анализ образцов слезы при поражении роговицы

Кератоконус – серьезное заболевание, которое может привести к необратимым процессам, в результате чего сильно снижаются и не восстанавливаются функции зрения. На основе полученных результатов проведенного множества научно-исследовательских работ, у больных кератоконусом найдена различная экспрессия цинк-α2-гликопротеина, лактоферрина и κ-цепи иммуноглобулина. Процедура электрофореза, проведенная с сульфатно-полиакриламидным гелем плюс масс-спектрометрический метод, применяемые при кератоконусе на протяжении проведения исследования взятых образцов позволяет обнаружить излишнюю экспрессию металлопротеиназы 1, иммуноглобулинов α- и κ, предшественников пролактина, лизоцима С и липокалина 1. Стоит предположить, что патология роговицы, ее преобразование и истончение при таком хроническом заболевании, в некоторой мере, характеризуются увеличением уровня протеаз и сниженным уровнем их ингибиторов. Эти изменения влияют на механические свойства коллагеновых волокон роговицы, являющихся важным звеном патогенеза кератоконуса и приводят к их потере.

Протеомный анализ у пациентов с глаукомой и катарактой

Патология, при которой возникают необратимые процессы и происходит атрофия ганглиозных клеток зрительного нерва, называется первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ). При этом на фоне повышенного внутриглазного давления происходит заметное ухудшение функций зрения. Как правило, начало болезни бессимптомное. Этим вызвана важность нахождения белков-маркеров, которые бы при их выявлении в образцах могли бы помочь выявлению первичной глаукомы на ранних стадиях.

На основании имеющихся данных при начинающейся патологии ПОУГ в образце уже на раннем этапе выявляется увеличенный уровень белкового воспаления (белок S100). Однако на данный момент одиночного специфичного белка, либо соединения белковых молекул, которые являются патогномоничными для первичной глаукомы, обнаружено не было. Стоит добавить умозаключение многих специалистов, которые к наиболее перспективному биологическому материалу для проведения протеомного анализа при заболевании ПОУГ относят влагу передней камеры. Это связано с тем, что она напрямую контактирует с дренажной системой угла передней камеры. Ее сбор проводится оперативным вмешательством после проведения парацентеза роговицы, либо при факоэмульсификации. Чтобы качественно и количественно оценить протеом влаги передней камеры у обследуемых, проводят жидкостную хроматографию вместе с тандемной масс-спектрометрией высокой точности.

Благодаря протеомному анализу водянистого образца, который взяли у больных на ранней стадии глаукомной патологии, в тандеме с псевдоэксфолиативным синдромом и катарактой, можно было выделить 12 уникальных белковых веществ: аполипопротеин C-III, коллаген α2(I) цепь и α3 (IX) цепь (collagen α-2(I) и α-3(IX) chain), нейроэндокринный регуляторный пептид-1, -2 и др. Большинство из перечисленных белков являются ингибиторами эндопептидаз, в задачи которых входит регуляция обмена веществ во внутриглазной жидкости. Дисбаланс ингибиторов эндопептидаз, задача которых не допустить активизацию процесса патологического протеолиза – одна из важных составляющих патогенеза ПОУ.

Необходимо добавить, что у людей с диагнозом ПОУГ были обнаружены матриксные металлопротеиназы во влаге передней камеры. Именно они способствуют разрушительному процессу базальных клеточных мембран и растворению элементов межклеточного матрикса, при котором активируются ангиогенные факторы роста – эндотелиальный фактор роста сосудов А и фибронектина. Проведенная протеомика дала возможность увидеть и повышенный уровень CD44 (гликопротеин). Он регулирует перемещение клеток и адгезивный проесс, а также отвечает за межклеточные взаимодействия. Он же является и рецептором для гиалуроновой кислоты, отдельных лигандов и матриксных металлопротеиназ. Если экспрессия этого белкового вещества будет повышена, то это приведет к уменьшению уровня гиалуроновой кислоты. Это означает, что на трабекулярном аппарате этот факт скажется отрицательно, поскольку ускорит апоптоз ганглионарных клеток сетчатки.

Стоит отметить, что  в образце, взятом у больных с ПОУГ Самохина Н.И. совместно с соавторами выявили особый белок, являющийся ингибитором пептидазы (pigmentepitheliumderivedfactor – фактор пигментного эпителия, genename SERPIN F1), относящийся к семейству серпинов – протеинов, ингибирующих пептидазы. На основании изученной литературы известно, что обнаруженный белок – это природный ингибитор ангиогенеза, в задачи которого входит защита  ретинальных клеток от апоптоза.  Этот белок синтезируют клетки пигментного эпителия сетчатки.

Необходимо добавить, что протеомика взятых образцов при диагнозе ПОУГ позволяет проводить идентификацию уникального белка – аполипопротеина D. При псевдоэксфолиативном синдроме типичным является сниженный уровень этого белкового вещества. Если это уменьшение средней силы сигнала аполипопротеина D будет меньше, чем 4,8×10-7 мг/кг, то можно предвидеть развитие данного заболевания, чувствительность которого 72,7 % и специфичность 100 %. Снижение этого уникального белка в образце при таком патологичном изменении говорит о том, что защитные механизмы снижены, а это значит, что на структурах переднего отрезка глазного яблока могут появиться псевдоэксфолиации. Стоит заметить, что аполипопротеин D был найден и в водянистой влаге передней камеры взятых образцов, тогда как в слезной жидкости у больных с глаукомой и псевдоэксфолиативной патологии его не нашли. Скорее всего, это говорит о специфичности выработки антител.

Дополнительно нужно отметить, что было найдено еще одно существенное белковое соединение при диагнозе псевдоэксфолиативная глаукома. К нему относится фибронектин – адгезивная молекула для соединительной ткани (относится к тканевой форме белка) и биологических жидкостей (относится к плазменной форме). В задачи этого гликопротеина внеклеточного матрикса входит выполнение регуляторной и стабилизационной функции при взаимодействиях между клетками.  На основе литературных данных это вещество выявляется в дренажной системе угла передней камеры глазного яблока и в одном из составных веществ псевдоэксфолиаций у испытуемых с разными видами глаукомы. Стоит заметить, что уровень этой адгезивной молекулы значительно выше у больных с диагнозом псевдоэксфолиативная глаукома, по сравнению с уровнем у обследуемых с диагнозом ПОУГ.

Псевдоэксфолиативная глаукома развивается и прогрессирует из-за повышенного содержания в образцах металлопротеиназа 2 и 3 типа, а также ингибитора металлопротеиназы 2 типа. Это говорит о том, что нарушен баланс между протеолитическими ферментами и их эндогенными ингибиторами, которые являются частицей патогенеза глаукомы, относящейся к псевдоэксфолиативному типу.

У обследуемых с диагнозом катаракта протеомный анализ показал наличие 26 белков в образцах: α-кристаллин (CRYA), корнеодесмосин, α-цепь тубулина, витамин K-зависимый белок. Они являются составной частью хрусталика. Их присутствие во влаге передней камеры объясняется происходящими биохимическими реакциями во время развивающего процесса катаракты. За оптимальное состояние хрусталика и его мутационные процессы отвечают гены α-кристаллина A (CRYAA), β-кристаллина A3 (CRYBA3) и β-кристаллина A4 (CRYBA4). Они же и стимулируют выработку различных белков, которые уменьшат прозрачность хрусталика. Если пептидазная деятельность влаги передней камеры активизируется, то происходит протеолиз субъединиц коннексинов и появляются щели между волокнами хрусталика, что приводит к их развивающемуся разрушительному процессу и прогрессированию катаракты.    

Протеомика при возрастной макулодистрофии и диабетической ретинопатии

Этот метод на данный момент только начинают активно применять на практике для нахождения биомаркеров патологического процесса заднего отрезка глаза у испытуемых с возрастной макулодистрофией, диабетической ретинопатией и при других офтальмологических заболеваниях.

На  этот момент у испытуемых с разными видами макулярной патологии во взятых образцах было выделено 342 белка. Выделенные белковые вещества провоцируют развивающийся процесс оксидативного стресса и воспаления, обеспечивая и неоваскуляризации хориоретинальных структур у больных. У обследуемых с диагнозом возрастная макулодистрофия обнаружены следующие протеины: шутин 1, гистатин 3, фидгетин-подобный белок 1, цитоплазматический актин 1, пролактин-индуцируемый белок 1 и S100-A7A.

Цель протеомики слезы у испытуемых с диагнозом диабетическая ретинопатия – выявить биомаркеры этого заболевания. На основании общепринятого мнения стоит отметить, что  данное протеомное картирование дает больше информации, чем изучение состава белка плазмы крови, поскольку подвергается множественным изменениям из-за гипергликемии и гликозилирования белков у людей с диабетом. У обследуемых в слезной жидкости обнаруживается значительное изменение белковой экспрессии (белки: липокалин 1, лакритин и лактоферрин). В дальнейшем это может быть использовано как эффективный скрининг диабетической ретинопатии.

Выводы

Итак, на основании проведенной работы, можно заключить, что протеомный анализ является наиболее информативным и перспективным способом, позволяющим проводить диагностику значимых в социуме заболеваний, связанных с глазами. Введение в практику сверхточной масс-спектрометрии совместно с цифровыми технологиями для получения необходимой информации и ее обработки дает широкие возможности перспективного развития протеомики и введение более персонализированного медицинского вмешательства. Информация, полученная посредством протеомного анализа – это новые основополагающие знания, раскрывающие суть патогенеза разных офтальмологических патологий на молекулярном уровне. Это поможет выявлять каждое отдельное протекание патологии методом нахождения связей между генотипом и фенотипом больного, а также подбирать индивидуальное лечение.